Секреторная карцинома молочной железы — это инвазивный рак, состоящий из эпителиальных клеток с внутриклеточными секреторными вакуолями и внеклеточных эозинофильных пузырьков с секретом, имеющих различное строение.
Опухоль может локализоваться в любом сегменте молочной железы и, как правило, характеризуется медленным ростом, а сам узел безболезненный и смещается относительно окружающих тканей, иногда в опухолевый процесс вовлекается сосок [1].
При лучевых исследованиях выявляется опухолевое образование с четким контуром, дольчатого строения, больше напоминающее доброкачест-венную опухоль [2].
Этот вид опухоли очень редкий и встречается менее чем в 0,05% всех инвазивных карцином молочной железы, чаще выявляется у женщин, но может быть у мужчин и у подростков. Возраст больных колеблется от 3 до 87 лет, средний возраст пациентов 53 года [3, 4].
При макроскопическом исследовании обычно диагностируется одиночный узел с четкими контурами, серовато-белой или желтоватой поверхностью на разрезе. Реже выявляются множественные очаги. Средний диаметр описанных образований — 2 см, но размеры варьируют от 0,5 до 16 см.
Секреторные карциномы содержат полигональные клетки с эозинофильной гранулированной или вакуолизированной цитоплазмой, круглыми и овальными ядрами. Опухоль может формировать микрокистозные, ячеистые, солидные, тубулярные и папиллярные структуры.
Микрокистозные участки могут симулировать тиреоидные фолликулы. Большинство секреторных карцином смешанного строения. Ядерный полиморфизм, как правило, слабый или умеренный, митотическая активность низкая.
Опухоль обычно имеет 1-ю или 2-ю градацию по Ноттингемской системе, high-grade-карциномы встречаются исключительно редко.
Клетки секреторной карциномы при иммуногистохимическом исследовании обычно диффузно экспрессируют CEA, S100, маммаглобин, SOX10, MUC4.
В большинстве из них выявляются базальные маркеры (СК5/6, EGFR), хотя и фокально. GATA3, CK8/18, CD117 и виментин также могут быть позитивными.
Хотя подавляющая часть этих карцином имеет тройной негативный фенотип (негативные ER, PR, HER2), однако уровень экспрессии Ki-67 часто ниже 20% [3].
Дифференциальный диагноз секреторной карциномы включает инвазивный рак с апокриновой дифференцировкой (обычно андрогенпозитивный), ацинозно-клеточную карциному, столбчато-клеточную карциному с обратной полярностью, кистозную гиперсекретирующую карциному in situ.
По данным молекулярно-генетических исследований секреторная карцинома молочной железы часто ассоциируется со слиянием генов ETV6—NTRK3 [3].
Нейтрофильные тропомиозиновые рецепторы тирозинкиназы (NTRK) — это семейство из трех протоонкогенов, NTRK1, NTRK2 и NTRK3, которое кодирует соответственно 3 белка: TrkA, TrkBи TrkC.
В норме эти белки вовлечены в различные биологические процессы, в том числе дифференцировку клеток и приспосабливаемость к изменению физиологических условий вокруг клетки. В различных опухолях в онкогенный процесс вовлекаются различные домены NTRK [5].
Учитывая потенциальную онкогенную активность, перестройки NTRK стали очередной терапевтической мишенью для таргетной терапии [6—10].
Для определения имеющейся перестройки используется ряд диагностических методов: секвенирование нового поколения (NGS), обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) и классическая иммуногистохимия [11, 12].
Безусловно, NGS является одним из самых чувствительных и специфичных тестов и в большинстве случаев будет работать независимо от гена-партнера, определяя все множество различных транслокаций NTRK.
Однако методы на основе ДНК-секвенирования могут быть сложными для разработки панели из-за большого размера интронов генов NTRK.
Помимо этого метод весьма дорогостоящий, требующий времени для проведения, надлежащее оборудование и квалификацию специалистов, что делает его непригодным для использования в качестве скрининга [13].
ПЦР также высокочувствительный метод, при этом более экономичен и не требует значительного времени для выполнения. Недостатком является невозможность выявить перестройки, не заложенные в диагностическую панель, а также необходимость проведения индивидуальной пробы для каждой транслокации [14].
Флюоресцентная гибридизация in situ может определять неизвестные транслокации NTRK, однако при этом используются три зонда отдельно для каждого гена NTRK, а для известных транслокаций (например, NTRK3—ETV6 при инфантильной фибросаркоме) — специфичные пробы [13]. Анализ может быть выполнен достаточно быстро (в течение 2 дней), хотя и требует специального оборудования для оценки. Основными недостатками метода являются высокая стоимость (необходимо три зонда) и достаточный объем опухолевого материала.
Объективным и доступным методом скрининга может быть иммуногистохимический метод. Обладая сравнительно невысокой специфичностью, метод весьма чувствителен, доступен по стоимости и времени, а также не требует большого объема материала [14].
Антитела к panTRK в отличие от всех описанных выше методов созданы для выявления наличия белков семейства TRK, а не генов в ДНК или РНК опухолевых клеток.
В настоящее время для иммуногистохимических исследований чаще всего используется тест VENTANApan-TRK (EPR17341), выявляющий С-концевую область тропомиозин-рецепторной киназы А, В и С, присутствующую в белках дикого и химерного типа.
В зависимости от того, какие произошли мутации в клетке, реакция с антителами дает ядерное, перинуклеарное, мембранное, цитоплазматическое окрашивание различной интенсивности или комбинацию вариантов [5]. Это усложняет метод, делает его более субъективным и оставляет ему место только в рамках скрининга [11].
Зачем нужно определять транслокации NTRK? Согласно данным G.Demetri и соавт.
[15] применение энтректиниба (ингибитора TrkA/B/C и ROS1) способно обеспечить частоту объективного ответа 57,4% (95% ДИ 8,0—14,9) при наблюдении пациентов с местно-распространенными и метастатическими опухолями с транслокацией NTRK в течение 15,5 мес. При этом медиана времени без прогрессирования заболевания составила 11,2 мес (95% ДИ 7,1—NR).
Перестройки NTRK чаще всего встречаются в редких опухолях, таких как секреторная карцинома молочной железы, аналог секреторной карциномы слюнной железы (MASK), врожденная инфантильная фибросаркома и врожденная мезобластная нефрома, а также в некоторых других опухолях детского возраста [16].
В ряде исследований показано, что частота встречаемости реаранжировки гена NTRK в солидных опухолях невысока и составляет в карциномах молочной железы от 0,18% [17]. Однако в некоторых редких опухолях, например секреторной карциноме слюнной железы или в воспалительной миофибробластической опухоли, может встречаться достаточно часто.
Это показывает важную роль патолога в выборе пациентов для выявления генетических перестроек в гене NTRK на основе морфологического исследования.
Для определения тактики лечения в клинику ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава РФ обратилась пациентка К., 51 год, которая в октябре 2019 г. самостоятельно нащупала уплотнение в правой молочной железе, обратилась в региональную больницу, где провели УЗИ, маммографию и core-биопсию образования.
На основании полученных данных был выставлен диагноз: С50.4 Злокачественное новообразование верхненаружного квадранта молочной железы, рак правой молочной железы, T2N0M0. Стадия IIA.
Гистологическое заключение: аденокистозный рак, реакции с антителами к эстрогеновым, прогестероновым рецепторам и HER2 отрицательные, Ki-67 — 7%. Принято решение о проведении операции на первом этапе.
По результатам патолого-анатомического исследования операционного материала обнаружен беловатый опухолевый узел с четкими контурами размером 2,5×2,5×2 см, диагноз: инфильтративная карцинома неспецифического типа, G2, pT2N0.
При пересмотре препаратов биопсийного и операционного материала в лаборатории клиники РМАНПО в опухоли выявлены полигональные опухолевые клетки с эозинофильной цитоплазмой, округлыми ядрами и множеством внутри- и внеклеточных вакуолей, заполненных слизью.
Клетки формировали преимущественно микрокисты и фолликулоподобные структуры, мелкие солидные скопления (рис. 1, 2). Некоторая деформация опухоли в биопсии диктовала необходимость дифференциального диагноза с аденокистозной карциномой, однако клетки опухоли не были базалоидными и не формировали розетковидных структур.
Заключение: секреторная карцинома молочной железы, ICD-O-code — 8502/3, G2, pT2N0, R0, LVI0, VI0.
Рис. 1. Секреторная карцинома молочной железы, биопсийный материал, ×10.
Рис. 2. Секреторная карцинома молочной железы, операционный материал, ×20.
Учитывая последние данные об эффективности энтректиниба в лечении секреторных карцином молочной железы, пациентке рекомендовано проведение анализа для определения экспрессии белка TRK и наличия мутаций в генах NTRK.
Для исследований методом иммуногистохимии были изготовлены срезы толщиной 4 мкм и помещены на положительно заряженные предметные стекла. Иммуногистохимическое исследование выполнено с антителами VENTANA pan-TRK (EPR17341) Assay в иммуностейнере VENTANA Bench Mark ULTRA.
Для детекции применялся набор Opti View DAB IHC Detection Kit (VENTANA) по стандартному протоколу, рекомендованному производителем.
В качестве контроля использован реагент негативного контроля (Rabbit Monoclonal Negative ControlIg VENTANA) и внутрилабораторный позитивный контроль (ткань аппендикса). Оценивалась реакция различной локализации (ядерная, цитоплазматическая).
Для исследования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) приготовлены срезы толщиной 3 мкм, которые после депарафинизации и протеолиза гибридизовались с пробой NTRK3 Break Apart FISH Probe Kit (производство компании CytoTest, США) согласно протоколам производителя с незначительными модификациями. Результат гибридизации оценивался после просмотра препарата в флюоресцентном микроскопе Axioimager Z2 (Zeiss, Германия). Исследовался весь препарат, подсчитывалось не менее 100 опухолевых клеток в 4 различных зонах. Признаком перестройки гена NTRK3 считалось обнаружение более 15% ядер опухолевых клеток с расщепленным сигналом (расхождение сигналов более, чем на 2 диаметра наибольшего, красного сигнала) или с отдельно лежащими красными сигналами, соответствующими тирозинкиназному домену исследуемого гена.
Результаты иммуногистохимического исследования и FISH-метода продемонстрировали следующее: на срезах с иммуногистохимическим окрашиванием с антителами VENTANA pan-TRK (EPR17341) Assay обнаружена положительная реакция в ядрах части опухолевых клеток, что оценено как положительный результат (рис. 3). Учитывая специфику иммуногистохимического выявления белков TRK, в лаборатории молекулярной биологии МГОБ №62 было также проведено FISH-исследование, по результатам которого реаранжировка гена NTRK3 была подтверждена (рис. 4, а, б). При оценке исследуемого образца обнаружено, что 80% опухолевых клеток демонстрируют признаки транслокации гена NTRK3. В клетках выявлялся один слитный сигнал, соответствующий неперестроенному гену NTRK3, и 1—2 пары расщепленных сигналов, указывающих на наличие перестройки. Таким образом, транслокация исследуемого гена была подтверждена.
Рис. 3. Иммуногистохимическая реакция с антителами к pan-TRK, ×20.
Рис. 4. Результаты FISH-исследования перестроек в гене NTRK3 (а, б).
Слитные сигналы соответствуют неперестроенному гену, раздельно лежащие сигналы подтверждают транслокацию.
Пример данного клинического случая показал необходимость внимательного отношения патолога при рутинном гистологическом исследовании рака молочной железы. Следует всегда помнить о редких морфологических вариантах, имеющих индивидуальный прогноз и чувствительность к терапии.
Так, при некоторых вариантах (тубулярная и крибриформная карцинома) можно ограничиться только хирургическим лечением на начальных стадиях заболевания. При выявлении нейроэндокринной дифференцировки возможна коррекция лекарственной терапии.
Устанавливая секреторный рак молочной железы, необходимо провести первичное иммуногистохимическое исследование и обязательно направить материал для подтверждения транслокации гена NTRK3 на молекулярно-генетическое исследование.
Это позволит пациентам с таким диагнозом получить адекватное таргетное лечение.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
<
NTRK мутация — сдать анализ на генетическое слияние в Onco Rehab
Анализ на слияние с участием генов NTRK: для чего?
Для чего?
Благодаря международному сотрудничеству, в частности, с Chemo Termia Oncology Center в клинике интегративной онкологии Onco.Rehab сегодня можно проводить исследования, помогающие выявить генетические изменения в злокачественном новообразовании, а следовательно, назначить оптимальное лечение.
Речь идет о новейшем анализе на слияние с участием генов NTRK.
Препарат для лечения онкологии с генетическими мутациями одобрен в США и ряде европейских стран. Инновационное исследование на слияние с участием генов NTRK позволяет понять, эффективен ли он для лечения больных с опухолью неоперабельной, с присутствием метастазов, когда классические методы лечения бессильны.
Гены: их роль и воздействие
Хорошо известно: клетки нашего организма действуют не хаотично, а в соответствии с программой, неким кодом, заложенным в ее ДНК.
Именно гены ответственны за все протекающие процессы, например, размножение клеток, их рост. Когда происходят изменения, система регуляции выходит из строя. В результате этого клетка игнорирует сигналы, поступающие от молекул посланные ей, и, превратившись в раковую, начинает бесконтрольно размножаться.
Сегодня большинство генов, в которых изменения ведут к раковой мутации, идентифицированы. Их принято классифицировать в 3 группы:
- Онкогены (сюда входят, например, HER2, RAS). Их функция кодировать белки, способствующие чрезмерному размножению клеток и защищающие их от апоптоза. Это важная роль, так как в случае чрезмерной активизации белка здоровая клетка становится патогенной.
- Гены-супрессоры опухолей(например, BRCA1, BRCA2, TP53). Их функция прямо противоположна и состоит в ограничении роста клеток, в инициировании в них апоптоза. В данном случае причиной мутации клеток становится их недостаточная активность.
- Гены репарации. Когда в молекуле ДНК начинаются изменения, гены этой группы начинают ей препятствовать, при слабой работе этих генов ДНК все больше изменяется.
Если становится ясно, что в раковой опухоли есть определенная мутация, как объект для воздействия лекарственного препарата можно избрать белок, способствующий бесконтрольному размножению патогенных клеток.
Но проблема состоит в том, что для подбора такого препарата необходимо знать, какой именно это белок. Вот здесь на помощь медикам и приходят молекулярно-генетические исследования.
Бесконтрольность белков и сдерживающие препараты
TRK – это аббревиатура, обозначающая международное название отропомиозин-рецепторной киназы. Так называется белок, локализующийся в мембране клетки. Функции его различны, но для онкологии важна, прежде всего, одна из них – помощь в избегании апоптоза клетки.
- Самые частотные типы названного рецептора – TrkA, TrkB и TrkC.
- NTRK1, NTRK2 и NTRK3, являющиеся генами NTRK (гены нейротрофической рецепторной тирозинкиназы), кодируют эти рецепторы.
- Любые мутации в этих генах становятся причиной активации белков Trk, что инициирует развитие ряда злокачественных новообразований, например, опухоли легких.
- В NTRK-позитивных опухолях нередко выявляется сращение генов, что также является разновидностью мутационного процесса.
В современной медицинской практике используются ингибиторы Trk, т.е. препараты, способные блокировать белки супер-активные:
Ларотректиниб. Это ингибитор TrkA, TrkB, TrkC. Одобрен FDA в конце 2018 года. Применяется при лечении некоторых типов NTRK-позитивного метастазированного рака, в случае безрезультатности других видов терапевтического лечения.
Клинические исследования показали эффективность препарата в лечении любой опухоли.
Результаты: у 75% пациентов – ответ на лечение, 22% — опухоль исчезла полностью, 53% – уменьшилась наполовину.
Еще один препарат из этой серии – Энтректиниб. Является ингибитором TrkA, TrkB, TrkC и ряда других белков.
Создание эффективного препарата – лишь один из шагов в борьбе с раковыми заболеваниями. Одна из важнейших роль в этой борьбе отводится методам диагностики. Именно она поможет специалисту-онкологу разобраться в вопросах мутации NTRK и назначении оптимального лечения.
Диагностика
- Диагностировать чрезмерную активность белков Trk можно, используя метод иммуногистохимического анализа.
- Суть анализа состоит в обработке ткани опухоли антителами с меткой, которые, соединившись с Trk, окрасят их.
- Проблема в том, что метод недостаточно точен в отношении гена NTRK3: примерно в 50% случаев мутация не обнаруживается.
- Сегодня как решение проблемы предлагается секвенирование РНК.
- Используемая рибонуклеиновая кислота (РНК) со стопроцентной точностью воспроизводит генную информацию.
- С помощью секвенирования РНК можно выявить слияние с участием генов NTRK в раковых опухолях.
- Плюсы:
- Чувствительность высокого уровня;
- Высокая точность.
Современные исследования идут в трех направления:
- Изучение биоптата на выявление изменения генов NTRK1, NTRK2 и NTRK3. Данный анализ применим для определения эффективности ингибиторов TRK у заболевших немелкоклеточным раком легких, онкологией щитовидной железы, глиобластомой.
- Анализ комплексный. Кроме секвенирования, проводят иммуногистохимическое исследование с целью оценки непостоянности и мутационной нагрузки опухоли, а также сплайсинг РНК и метилирование промоторных генов. Это нужно для создания обстоятельного молекулярно-генетического описания новообразования, для последующего подбора оптимальных медикаментов для конкретного больного.
- Минимально инвазивное изучение. Для проведения секвенирования и выявления мутаций в генах NTRK достаточен анализ крови больного.
Молекулярно-генетические исследования дают понимание, какое лечение следует назначить конкретному пациенту.
Важность их увеличивается, если речь идет о больных, страдающих неоперабельным раком с процессами метастазирования, в случае, когда назначенная до этого терапия не помогает.
В клинике интегративной онкологии Onco.Rehab следят за новыми достижениями в медицине, мы изучаем новые подходы к лечению, используем их, чтобы помочь Вам.
Транслокации NTRK теперь в МГЦ «Геномед»
Поиск биомаркера, специфичного для назначения лечения вне зависимости от типа и локализации опухоли,впервые завершился успехом в 2017 году, когда FDA одобрило пембролизумаб для лечения любой солидной опухоли, демонстрирующей высокий уровень микросателлитной нестабильности.
Позже, в 2018 году FDA также ускорено одобрило ларотректиниб, ингибитор тропомиозин-рецепторной киназы, для пациентов с любыми метастатическими солидными опухолями, имеющими транслокации с участием генов NTRK. В клинических исследованиях препарат продемонстрировал высокую общую частоту ответа (75%) у взрослых и детей с различными новообразованиями.
В нашей лаборатории появились исследования, позволяющие диагностировать транслокации с участием генов NTRK, однако вопросы, каким пациентам рекомендовать диагностику и какой метод для этого выбрать, остаются открытыми.В данном кратком обзоре мы постараемся на них ответить.
Гены NTRK и их роль в канцерогенезе
Гены NTRK1, NTRK2 и NTRK3 кодируют 3 основных рецептора семейства тропомиозин-киназ (Trk): TrkA, TrkB и TrkC. Эти рецепторные тирозинкиназы экспрессируются в нервной ткани и играют важную роль в физиологичном развитии и функционировании нервной системы посредством активации нейротрофина, имеющего основополагающее значение для развития и функционирования головного мозга.В злокачественных новообразованиях транслокации с участием генов NTRK приводят к изменению тропомиозинкиназ, способных активировать сигнальные пути, связанные с пролиферацией опухолевых клеток.
Транслокации NTRK являются драйверными онкогенными перестройками и обычно не встречаются с другими транслокациями, приводящими к активации киназ (ALK, ROS1 и другие).
Транслокации NTRK встречаются примерно в 1% случаев солидных опухолей детей и взрослых. Однако некоторые редкие злокачественные новообразования демонстрируют достаточно высокий процент встречаемости, так при аналогичной секреторной карциноме молочных желез частота обнаружения транслокации достигает 90–100%.
Частота встречаемости транслокаций NTRK при различных новообразованиях
| Высокая частота встречаемости (>80%) | Взрослые |
|
| Дети |
|
|
| Средняя частота встречаемости (5-25%) | Взрослые |
|
| Дети |
|
|
| Низкая частота встречаемости (менее 5%) | Взрослые |
|
| Дети |
|
ГИСО — Гастроинтестинальная стромальная опухоль, ОЛЛ — Острый лимфобластный лейкоз, ОМЛ — Острый миелоидный лейкоз, ММ – множественная миелома
Методы диагностики транслокаций NTRK
Для достижения наибольшей клинической эффективности ингибиторов TRK необходима правильная диагностическая стратегия обнаружения слитых генов NTRK в образцах опухоли.
Методы диагностики транслокаций NTRK на сегодняшний день включают: иммуногистохимию (ИГХ), флуоресцентную гибридизацию insitu (FISH), полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR), секвенирование следующего поколения (NGS) ДНК или РНК.
ИГХ позволяет диагностировать избыточную экспрессию TRK, обеспечивая доступную и быструю диагностику, которую можно использовать в качестве скрининга.
Несколько исследований продемонстрировали успешное обнаружение положительной экспрессии TRK с помощью пан-ТРК моноклональных антител, однако положительные результаты ИГХ в ряде случаев следует подтверждать молекулярно-генетической диагностикой т.к.
гиперэкспрессия белков TRK дикого типа также может быть расценена как положительный результат.
Использование FISH зондов для определения транслокаций с участием генов NTRK также является хорошо известным методом для выявления клинически значимых слитых генов.
Простота и точность диагностики достигается использованием трех специфичных зондов, направленных на диагностику разрыва генов NTRK1/2/3, при этом нет необходимости точно знать партнерский ген, участвующий в образовании слитого гена.
Тем не менее, ложные результаты при использовании данного метода также сообщаются у небольшого процента пациентов в ряде исследований, что может быть связано со сложными хромосомными перестройками в опухоли.
RT-PCR обеспечивает альтернативный подходобнаружения слитых с NTRK генов с использованием праймеров к кодирующей последовательности 5' конца партнерского гена и к последовательности киназного домена NTRK.
Недостатком RT-PCR является большое количество партнерских генов, усложняющих комплексный мультиплексный анализ.
Для создание тест-системы необходима точная информация о всех партнерских генах, которых насчитывается несколько десятков.
Секвенирование следующего поколения NGS представляет точный метод для обнаружения слитых с NTRK генов, с высокой чувствительностью и специфичностью. Технология может основана на секвенировании ДНК или РНК.
И хотя NGS панели генов на основе ДНК могут обнаруживать множественные онкогенные события, не все платформы достоверно идентифицируют все варианты слияния с генами NTRK, особенно с генами NTRK2 и NTRK3, при которых диагностика осложняется наличием протяженных интронов.
Преимущество NGS на основе РНК заключается в том, что секвенирование сфокусировано на зрелой мРНК и не затрагиваетинтроны. Недостатком метода является высокая зависимость от качества РНК, которое часто бывает неудовлетворительным при работе с тканью, полученной из парафиновых блоков.
Алгоритм диагностики транслокаций NTRK
В опухолях с высокой частотой встречаемости транслокаций с участием генов NTRK, рекомендуется FISH диагностика в качестве первой линии диагностики, и ИГХ метод при недоступности FISH теста.
Положительный результат ИГХ теста может быть подтвержден NGS тестом. В солидных опухолях, где частота встречаемости транслокацийNTRK от 5-25% предпочтительнее использовать NGS панель, которая включает слитные геныNTRK.
Для опухолей с низкой частотой встречаемости генов NTRK (
Genetics-info — Полное секвенирование генома: инструкция по применению
Интерес к теме полного секвенирования генома во многом стимулируется коммерческими лабораториями, которые предлагают клиентам узнать все о своем геноме, чтобы правильно подобрать диету, определить таланты, узнать свою этническую принадлежность.
Однако полное секвенирование генома — серьезный медицинский инструмент, который позволяет диагностировать наследственные болезни.
О том, кому нужно секвенирование генома и как правильно им воспользоваться, рассказал кандидат биологических наук, руководитель Лаборатории Клинической Биоинформатики Федор Коновалов.
53229 • • 29.11.2018
— Что дает анализ «полное секвенирование генома»?
— Строго говоря, полное секвенирование генома — не медицинский анализ, это просто способ получения генетической информации. В ходе секвенирования прочитывается практически весь геном человека.
Сегодня используется такой подход: ДНК случайным образом разрезается на множество мелких фрагментов, к фрагментам добавляются специальные адаптеры на концах, и затем их количество нарабатывается с помощью ПЦР.
После все эти кусочки параллельно «читаются», специальные программы «собирают» из них геном и выявляют изменения в нем относительно так называемого референса – это искусственная стандартная последовательность генома, своеобразный пример для сравнения.
В ходе секвенирования генома можно проанализировать практически все гены, межгенные участки, митохондриальную ДНК.
В целом, полное геномное секвенирование хорошо справляется с выявлением «точковых» мутаций, а структурные изменения (транслокации, инверсии) выявляются хуже.
Поэтому в случае подозрений на такие хромосомные перестройки лучше использовать более надежные специализированные методы: таргетные тесты, FISH или кариотипирование.
- Использовать данные секвенирования можно по-разному, но мы остановимся на применении в медицинских целях.
- — Кому стоит задуматься о полном секвенировании генома?
- — Задуматься о нем имеет смысл тем, у кого есть причины для посещения врача-генетика.
Во-первых, полное секвенирование генома – инструмент для выявления причины наследственного заболевания.
Тест действительно универсальный, его особенность в том, что одновременно с «обычными» хромосомами читается и митохондриальная ДНК: маленькая, но очень важная кольцевая молекула.
Однако здесь важно понимать, что есть типы мутаций, которые с помощью этого анализа не выявляются. Хороший врач на основе предполагаемого или уже существующего клинического диагноза выбирает метод для проведения анализа.
Во-вторых, секвенирование генома можно было бы использовать при планировании семьи – как метод скрининга на носительство патогенных мутаций, при наличии которых в одном и том же гене у обоих родителей в семье могут родиться дети с рецессивными заболеваниями.
Впрочем, когда есть популяционные данные о частых мутациях для определенного народа, вполне рационально будет провести не секвенирование генома целиком, а специальный тест на выявление этих часто встречающихся мутаций – так выйдет дешевле, но это поможет значительно снизить риск рождения больного ребенка. Кроме того, носительство некоторых частых и при этом тяжелых заболеваний (таких как спинальная амиотрофия) для надежной детекции требует специального теста, поэтому я бы не стал переоценивать возможности геномного секвенирования. Это в любом случае не метод, который позволит застраховаться от абсолютно всех генетических рисков.
В-третьих, полное секвенирование генома позволяет получить информацию о некоторых высокорисковых состояниях, например, о высокой вероятности заболевания раком молочной железы и яичников. Это актуально, например, для женщин, в семье которых были случаи рака молочной железы или яичников в молодом возрасте или несколько случаев рака молочной железы и яичников у нескольких родственников.
- К возможностям геномного секвенирования следует подходить разумно: эффективность анализа генома несколько выше, чем у менее масштабных, но тоже современных исследований (в частности, экзомного секвенирования), однако отличается не в разы, а лишь – в случае экзома – на несколько процентов.
- Сегодня я бы рассматривал геном скорее как исследование «последней линии» либо как выбор для тех, кто хочет получить максимум информации на будущее – ведь данные секвенирования можно при необходимости переанализировать.
- — Сколько стоит секвенирование генома?
— В рамках проекта «Геном человека» (международный проект, целью которого было определить последовательность нуклеотидов, которые составляют ДНК и идентифицировать 20—25 тыс. генов в человеческом геноме – G-I) ежегодно в течение 10 лет тратилось от 30 до 50 млн долларов.
Тогда геном секвенировали еще на капиллярных секвенаторах по одному фрагменту за раз; впрочем, и требования проекта были существенно строже, чем необходимо сейчас – ведь тогда речь шла о создании той самой референсной последовательности, с которой сегодня мы сравниваем данные.
При переходе на секвенирование нового поколения цена, конечно, значительно снизилась. Буквально 7 лет назад она составляла примерно 10 тыс. долларов. Сегодня цена полного секвенирования генома составляет менее 1 тыс. долларов в крупных лабораториях Китая и Кореи (без интерпретации). В России цена чуть выше – в районе 1,5-2 тыс. долларов.
— Что нужно знать пациенту/клиенту, чтобы подобрать лабораторию для проведения теста?
— В России рынок лабораторной геномики — это «Дикий Запад», где каждый ковбой сам за себя.
https://www.youtube.com/watch?v=_Owwe1rcmYo\u0026t=7s
Еще не сложились единые высокие стандарты – а точнее, не везде используются те международные рекомендации, которые считаются общепринятыми. Несмотря на это, хорошие лаборатории есть, и они следуют этим стандартам.
Для начала я бы описал, по каким параметрам не стоит выбирать лабораторию.
Во-первых, не нужно ориентироваться на цену. Есть мнение, что чем выше цена, тем выше качество. Это не так. Цена может быть ниже по многим причинам – например, лаборатория только вышла на рынок и хочет привлечь клиентов, или лаборатория пользуется более производительным секвенатором. В-вторых, не стоит выбирать клинику по красоте сайта: он должен быть прежде всего информативным.
Имеет смысл посоветоваться с врачом, которому вы доверяете. Если это врач, который придерживается позиций доказательной медицины, сам участвует в конференциях, следит за новостями медицинской науки и развивается как профессионал, то скорее всего он сможет вам порекомендовать хорошую лабораторию.
Также вы можете обратить внимание на деятельность сотрудников самой лаборатории. Если сотрудники публикуются в международных научных журналах, выступают на конференциях с докладами, показывают честную статистику – значит, скорее всего, это добросовестная команда.
Важно отметить, что качество результата складывается из качества собственно процедуры секвенирования и качества интерпретации.
В первом случае имеет значение избыточность данных (так называемая средняя глубина прочтения, или среднее покрытие) – от этого зависит качество выявления мутаций.
Заранее спросите: с каким средним покрытием секвенируется геном? Для генома это число должно быть выше 30x; для экзома и панелей – не менее 70x.
После проведения анализа имеет смысл запросить не только заключение, но и первичные данные секвенирования: по этим файлам можно оценить качество прочтения генома. Лучше делать это в другой, независимой лаборатории.
Что касается интерпретации данных – здесь все сложнее. Боюсь, что человек без специального образования и опыта не разберется во всех терминах современного генетического заключения. Однако ничто не мешает вам оценить аккуратность, с которой написано заключение.
В медицинской генетике формулировки играют огромную роль, и иногда одно-два слова полностью меняют клиническое значение той или иной находки. Если лаборатория за несколько десятков тысяч рублей не может выдать аккуратное, подробное и грамотно написанное заключение, значит, на всем остальном она тоже сэкономила.
Можно ли сказать, что полное секвенирование генома лучше заказывать за рубежом? (там делают качественнее или, возможно, дешевле?)
Как я уже говорил, в России есть хорошие лаборатории, работающие на мировом уровне. Другой вопрос: насколько вероятно получить качественную услугу, обратившись в случайно выбранную организацию? В случайно выбранной немецкой лаборатории все-таки выше вероятность найти достойное качество, чем в случайно выбранной российской.
На сложившихся рынках Запада меньше шарлатанов – требовательный рынок уже приучил своих участников работать хорошо. Сам я врачам и представителям пациентских организаций уверенно рекомендую сдавать анализ в России, но при этом имею в виду определенные лаборатории, которым доверяю.
Если врач не дал вам таких рекомендаций, и вы выбираете наобум – возможно, есть смысл обратить внимание на ведущие зарубежные предложения.
— Как проходит сам анализ?
— В качестве биоматериала обычно собирают венозную кровь, из нее выделяют ДНК, с которой затем проводят множество манипуляций. Сам процесс пробоподготовки и секвенирования сложный – он состоит из нескольких десятков этапов.
Есть заблуждение, что все, что необходимо для проведения теста – это секвенатор. На самом деле, в процессе участвует множество приборов. Но еще важнее работа специалистов.
Подготовка «библиотек» (наборов фрагментов ДНК для секвенирования) – сложная и ответственная задача; на последних этапах стоимость ошибки сотрудника лаборатории может составлять миллион рублей и выше; и это если считать только стоимость потраченных реагентов.
Секвенатор анализирует «библиотеку» ДНК автоматически. На выходе получаются «сырые данные» объемом десятки и сотни гигабайт.
С ними уже работают биоинформатики: они выявляют генетические изменения, анализируют их по нескольким десяткам параметров, сопоставляют с базами данных, представляют информацию в структурированном виде – и в конечном итоге помогают врачам принимать информированные и обоснованные решения о том, что считать причиной заболевания.
В России полное секвенирование генома занимает от 1,5 до 4 месяцев. В действительности, если на всех этапах работать максимально оперативно, то можно уложиться в 10 дней. Но это практически предел.
— Насколько это точный тест?
— Анализ «полное секвенирование генома» нельзя считать самостоятельным диагностическим тестом.
Для генома нельзя измерить чувствительность и специфичность в отношении выявления всех возможных мутаций.
Существуют гены, расположенные в очень сложных для чтения участках; есть гены, у которых в хромосомах есть очень похожие на них копии – псевдогены; в таких случаях точность и даже сама возможность детекции уже ниже. Поэтому результаты геномного секвенирования необходимо проверять референсным методом.
Допустим, в заключении приведены 4 мутации.
Врач-генетик смотрит на них, сопоставляет описание заболеваний с клиническими данными больного и определяет: какие из этих вариантов по сочетанию типа наследования, клинических признаков и других параметров могут иметь отношение к случаю пациента. И именно эти варианты дополнительно проверяют секвенированием по Сэнгеру, причем часто и у родителей больного.
С технической точки зрения у хорошей лаборатории ложных результатов почти не бывает, однако перепроверка никогда не будет лишней. Хуже другое – ложная классификация мутаций: прежде всего, сообщение под видом патогенных заведомо доброкачественных генетических изменений, которые не могут быть причиной заболевания.
Это проблема интерпретации, а не детекции. Врач должен быть очень бдительным. В заключении, если мутация описывается как патогенная или вероятно патогенная, лаборатория обязательно должна подтверждать свои слова ссылками на статьи или базы данных – и эта информация должна быть проверяемой.
Хорошее описание мутации в лабораторном заключении – это обычно увесистый абзац текста, со ссылками на литературу, номера в базах данных, с указанием численных параметров и точных координат мутации в разных форматах по международной номенклатуре.
Это делается не для того, чтобы «загрузить» врача – а чтобы можно было перепроверить сделанные выводы о патогенности мутации, не анализируя данные «с нуля».
При этом нет ничего плохого в сообщении вариантов с неопределенной клинической значимостью (а они часто встречаются в заключениях), когда такая классификация корректна.
Если убедительных данных за патогенность мутации или за ее доброкачественность сегодня нет, то по международным рекомендациям принято все же сообщать такие варианты, если они могут иметь отношение к заболеванию, но при этом честно указывать их неопределенный статус. После дополнительных исследований часто оказывается, что такие варианты сообщены не зря.
Вопрос «ложноотрицательных» результатов сложнее. В качестве таковых иногда рассматривают «пустое» заключение, например, если врач уверен в наследственной природе болезни пациента. Здесь не стоит спешить винить лабораторию – если, конечно, при перепроверке данных не выяснилось, что она упустила что-то очевидное.
Степень изученности групп заболеваний разная, далеко не для всех генов хорошо известна связь с той или иной патологией; поэтому, несмотря на бурное развитие технических методов, причину заболевания удается установить только у определенной доли пациентов – и эта доля сильно зависит от клинической картины.
В этом смысле статистика хороших российских лабораторий примерно сопоставима с мировой.
Интерпретация результатов генетических тестов очень сложна, как и сама медицинская генетика. Лучше доверить и назначение геномных исследований, и постановку диагноза на их основе опытному врачу.
Авторы: